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详细分析感受态细胞的操作方法和注意事项

发布时间: 2021-11-25  点击次数: 6次
  目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此 CaCl2法为使用更广泛。
 
  感受态细胞的操作方法:
  1、DH5α感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手bo打EP管底轻轻混匀,冰中静置25分钟。
  2、42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
  3、向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60分钟。
  4、5000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
  5、将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少15小时。
 
  注意事项:
  1、感受态的细胞在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。
  2、混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
  3、转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
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