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用这个方法操作克隆感受态细胞,简单易懂

发布时间: 2021-12-28  点击次数: 245次
  克隆感受态细胞主要采用理化方法诱导细胞,吸收周围环境中的DNA分子,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。它的主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。
 
  克隆感受态细胞操作方法:
  1、DH5α感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手bo打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25分钟;
  2、42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率;
  3、向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60分钟;
  4、5000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上;
  5、将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少15小时。
 
  注意事项:
  1、感受态细胞在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率;
  2、混入质粒或连接产物时应轻柔操作;
  3、转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

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