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分享几种常用的克隆感受态细胞

发布时间: 2022-07-26  点击次数: 19次
  克隆感受态细胞的主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入克隆感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。

  常用的几种克隆感受态细胞:
  1、常规克隆用的DH5α感受态;
  2、慢病毒载体转化用的stbl3;
  3、建库用的DH10B电转感受态细胞;
  4、用于重组蛋白表达的BL21(DE3)。

  克隆感受态细胞的制作方法:
  CaCl2法:
  1、将快速生长的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀,同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为克隆感受态细胞;
  细胞壁通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。
  联合其它的二价金属离子(如Mn、Co)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍。
  2、此时,将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激(90s),细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动,并随机出现许多间隙,外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
  3、将转化后的细胞在选择性培养基上培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

  电转法:
  电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便,愈来愈为人们所接受。

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