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HPLC检测服务

HPLC检测服务

简要描述:HPLC检测服务
本实验室采用岛津LC-20液相色谱仪,对样本进行高精度分析。服务详询工作人员。
实验项目名称液相色谱仪(本实验采用岛津液相色谱仪LC-20)
实验目的1)结合液相色谱仪实物,了解液相色谱仪的原理、结构;2)选用合适的样品,运用液相色谱仪进行样品检测。
实验要求1)简述液相色谱仪的原理、基本结构及特点;2)通过样品测试,叙述操作步骤,通过实验数据进行试验总结。

更新时间:2021-07-20

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主要用途仅用于科研应用领域医疗卫生,生物产业

一、本实验室采用岛津LC-20液相色谱仪,对样本进行高精度分析。服务详询工作人员。

实验项目名称

液相色谱仪(本实验采用岛津液相色谱仪LC-20)

实验目的1)结合液相色谱仪实物,了解液相色谱仪的原理、结构;2)选用合适的样品,运用液相色谱仪进行样品检测。
实验要求1)简述液相色谱仪的原理、基本结构及特点;2)通过样品测试,叙述操作步骤,通过实验数据进行试验总结。

二、HPLC检测服务实验原理

液相色谱法采用液体作为流动相,利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时,被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换,使溶质间微小的性质差异产生放大的效果,达到分离分析和测定的目的。被分离成单个组分后依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、液相色谱法的特点

高压——压力可达150~300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。

高速——流速为0.1~10.0 mL/min。

高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

高效液相色谱(HPLC)与经典液相色谱相比有以下优点:

速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg。

色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。

四、液相色谱仪的组成

液相色谱仪主要包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。

1 输液系统:

包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合HPLC要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小,通过柱子的流动相受到的流动阻力很大,因此需要高压泵输送流动相。

2 进样系统:

将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两项功能。

3 分离柱:

色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的HPLC微粒填料,如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。采用的固定相粒度甚至可以达到1μm,而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μm。HPLC填充柱效的理论值可以达到50000/m~160000/m理论板,一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。由于柱效内、外多种因素的影响,因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的死体积。

4 检测系统:

HPLC检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物(包括流动相和样品组分)的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器和磁光旋转检测器。这类检测器适用范围广,但是对于流动相有响应,受温度变化、流动相流速和组成变化的影响,检测灵敏度低,不能用于梯度洗脱的分离模式。专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感,可用于测量被分离组分某类特性的变化。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。

5 数据处理系统:

数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类,前者可以完成一般的色谱数据处理任务,有些软件可以实现部分仪器的控制功能。前者即一般的色谱工作站,后者通常称之为专家系统。
五、仪器、试剂

主要仪器:岛津液相色谱仪(LC-20)、10μL微量注射器、滤膜;

试剂:正己烷、异丙醇、待测样品;
六、实验步骤

  • 准备

  1. 准备所需的流动相,用合适的0.45um滤膜过滤,超声脱气20min;

  2. 根据待检样品的需要选择并安装好合适的色谱柱;

  3. 配置样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的0.45um滤膜过滤;

  4. 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常;

  5. 开机:接通电源,依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器,带泵和检测器自检结束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。

  • 参数设定

  1. 波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入波长值,按[enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕,也可以选择LC-solution 软件方便地设定;

  2. 流速设定:在A泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需的流速(柱在线时流速一般不超过1mL/min),按[enter]键确认。按[CE]键退出,也可以选择LC-solution 软件设定;

  3. 流动相比例设定:在A泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入流动相B的浓度百分数,按[enter]键确认。按[CE]键退出,也可在软件中设定。

  • 更换流动相并排气泡

  1. 将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中,逆时针转动A/B泵的排液阀180o,打开排液阀,按A/B泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以9.9mL/min的流速冲洗,3min(可设定)后自动停止,将排液阀顺时针转到底,关闭排液阀,如管路中有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。

  • 平衡系统

  1. 按A泵的[pump]键,A、B泵将同时启动,pump指示灯。用检验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相,观测泵控制屏幕上的压力值,压力波动应超过不超过1MPa。

  2. 观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为<0.001mV时,可认为系统已达到平衡系统,可以进样。

  3. 进样:将样品用滤膜过滤,用10uL玻璃注射器将样品液体从进样阀进样(注意,进样时,尽量不要让针头接触进样孔的壁),进好样后,进行测试,观察工作电脑桌面上液相曲线变化,测试完后停止进样,用电脑进行数据分析。

七、HPLC检测服务实验数据处理

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