Rosetta-gami B（DE3）感受态细胞

Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞

产品规格CAT#: BFNC86075-01(10×100ul)/BFNC86075-02(50×100ul)

Rosetta-gami B(DE3)：                             100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存条件(保质期)：                             -80℃（6个月）

基因型

F^- ompT hsdSB(r_B^-m_B^-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB pRARE (Cam^R, Kan^R, Tet^R)

产品说明

Rosetta-gami B(DE3) 菌株聚合了BL21，Tuner，Origami和 Rosetta四种菌株的优点：

＊ lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其Tuner菌株的优点——IPTG以均一速度进入体系中大肠杆菌的每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖。

＊ pRARE赋予其Rosetta菌株的优点——补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。

＊ gor522::Tn10 trxB赋予其Origami菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。

＊ 该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)适合T7启动子诱导的蛋白表达。

＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡那霉素，氯霉素，四环素抗性，由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率高达10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Rosetta-gamiB(DE3)菌株感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手bo打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所选质粒筛选抗生素的2YT 或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by

dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

注意事项

1. 感受态细胞尽量在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。

5. 为获得需要量的蛋白，诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

6. 具有卡那霉素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性质粒的表达。